I q b a l A l i . c o m

Rekombinasi Intergenik dan pemetaan Fag Bakteri

Rekombinasi genetik fag bakteri ditemukan pada infeksi campuran yang melibatkan dua strain mutan dibiarkan menginfeksi satu biakan bakteri yang secara simultan, karena melibatkan dua lokus berbeda yang menginfeksi satu biakan bakteri yang sama secara simultan. Maka terjadi rekombinasi intergenik.

Pada E coli T2 (Hersley dan Rotman, 1949). fag induk bergenotif h+r (rentang inang wild type, lisis cepat) dan hr+ (rentang inang lebar, lisis normal). Jumlah fag yang dintroduksi cukup menginfeksi tiap bakteri dengan jumlah lima buah. Setelah sebagian atau seluruh bakteri pecah dan sample turunan fag dari 40.000 bakteri tiap persilangan dibiakkan di cawan petri bercampur E. coli strain B dan B/2. Jika tidak berekombinasi maka kedua genotip induk ini ada pada genotip turunan.

Frekuensi rekombinan yang kecil banyak gen terangkai bersama sebagai satu kelompok, menunjukkan jarak kelompok pautan sama sebesar 30%. dinyatakan bahwa proses penggabungan (kombinasi) bebas (independent assortment) antara kelompok pautan ditandai frekuensi rekombinasi 30% dan bukan 50% sebagaimana diharapkan pada makhluk hidup yang lebih tinggi. Ini mengungkap bahwa tidak ada satu pun melewati frekuensi 30%.

Selain fag T2, percobaan juga dilakukan dengan memanfaatkan infeksi simultan tiga strain yang mana tiap strain melibatkan gen h, m dan r. Ada pertukaran genetik antara ketiga strain tersebut,yaitu 1) dua rekombinasi berturutan dalam sel sama; rekombinasi pertama berlangsung antara kromosom dua strain, kedua berlangsung antara strain rekombinan yang terbentuk dan strain ketiga; 2) terjadi “perkawinan serempak” antara ketiga kromosom dari ketiga strain pada waktu yang sama.

Peningkatan frekuensi ganda pada fag tidak terjadi karena ada peningkatan pertukaran genetik simultan yang riil pada dua interval kromosom berdekatan karena efek yang relatif kecil. Frekuensi rekombinasi ganda meningkat mencapai 30 kali lebih tinggi daripada frekuensi harapan atau disebut interferensi negatif tinggi (high negative interference) contoh pada persilangan tiga gen (three-point crosses).

Rekombinasi Intragenik

Rekombinasi intragenik yang dikemukakan Benzer (1950) mengkaji lokus rII fag T4 dan mengungkap keberadaan rekombinan genetik yang jarang terjadi akibat pertukaran dalam gen, dan bukan antar gen. dia juga menunjukkan bahwa rekombinasi terjadi antar DNA fag-fag bakteri selama infeksi simultan terhadap E-coli. Hasilnya terungkap peta lokus rII yang disebut analisis struktur halus gen. Proses kerja pertama yaitu mengisolasi sejumlah besar mutan di lokus rII fag T4 dan menghasilkan plak-plak yang berlainan jika dibiakkan pada cawan yang mengandung E-coli strain B dan mempermudah isolasi mutan. Kuncinya bahwa mutan-mutan rII tidak dapat lisis sempurna pada strain E-coli lain, yaitu K12 (λ) yang mengalami lizogenasi oleh fag λ, meskipun mutan itu mampu menginfeksi dan melakkukan lisis terhadap E.coli B.

Mutan menginfeksi dan melakukan lisis terhadap E.coli B. Fag strain wild-type melakukan lisis terhadap kedua strain yaitu strain B dan K12(λ)). Jika rekombinasi terjadi di lokus rII yang menghasilkan rekombinasi wild-type maka dapat hidup dalam sel E.coli K12(λ))dan mengadakan lisis sedang mutan rekombinan tidak.

Untuk mengungkap frekuensi rekombinanm, Benzer memanfaatkan teknik pengenceran serial, dengan teknik ini Benzer menentukan mutan rII E.coli B maupun jumlah total rekombinan wild-type yang lisis terhadap E.coli K12(λ). Benzer menemukan satu fag rekombinan wild-type yang tercampur diantara sekitar 100 juta fag turunan mutan. Benzer juga melakukan uji komplementasi, karena saat E.coli strain K12(λ) diinfeksi pasangan strain mutan berbeda, kadang K12(λ) juga lisis karena hanya strain rII wild-type yang menyebabkan E.coli K12(λ) lisis. Benzer berpendapat selama melakukan infeksi, tiap strain mutan memberi sesuatu yang tidak dimiliki strain lain, dan jika terjadi maka fungsi strain wild-type akan pulih.

Bilamana banyak pasangan mutan diperlakukan pada uji komplementasi maka pasangan mutan uji yang melakukan komplementasi satu sama lain dikelompokkan ke kelompok komplementasi yang lain, sedang yang tidak melakukan komplementasi dikelompokkan dalam kelompok komplementasi yang sama. Tiap kelompok komplementasi itu disebut cistron. Seluruh mutan pada lokus rII fag T4 dipisahkan jadi Cistron A dan B sebagai dua buah gen yang berlainan. Dari 20.000 mutan rII, separuh adalah cistron A dan separuhnya cistron B. Rekombinasi intragenik terungkap dengan memanfaatkan mutan dalam masing cistron. Total jumlah turunan dapat ditentukan berdasar jumlah plak. Nilai frekuensi rekombinan dipandang setara dengan jarak dua mutan (cistron yang sama). Jika mutan berlatar mutasi titik dalam daerah cistron yang mengalami delesi maka rekombinan wild-type tidak akan pernah muncul.

Peta genetik cistron A dan B menampakkkan tapak-tapak yang mengalami mutasi (sehingga mempunyai banyak mutan). Tapak-tapak itu dinamakan sebagai titik panas atau hot spots. Di tempat lain ada tapak yang tidak bermutasi (sehingga tidak mempunyai mutan). Hasil karya Benzer ini sangat spektakuler karena berhasil mendahului kajian molekuler gen rinci yang baru mempu dilaksanakan pada dekade 1960.